测定蛋白质的几种操作方法

2020-04-23 15:39:09      点击:
蛋白质测定是指通过物理或化学方法对蛋白质含量进行测定。蛋白质是构成人体细胞和组织的重要成分,蛋白质测定是生物化学和分子生物学研究中常用、基本的分析方法之一。
测定蛋白质的几种操作方法:
1.凯氏定氮法
准备4个50mL凯氏烧瓶并标号,想1、2号烧瓶中加入定量的蛋白质样品,另外两个烧瓶作为对照,在每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物,再加入浓硫酸,将4个烧瓶放到消化架上进行消化,之后进行蒸馏,全部蒸馏完毕后用标准盐酸滴定各烧瓶中收集的氨量,直至指示剂混合液由绿色变回淡紫红色,即为滴定终点,结算出蛋白质含量。
2.双缩脲法
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法,硫铵不干扰显色, Cu2+与蛋白质的肽键,以及酪氨酸残基络合,形成紫蓝色络合物,此物在540nm波长处有最大吸收。首先利用标准蛋白溶液和双缩脲试剂绘制标准曲线,将待测血清与硫酸钠在待测试管中混合,并用只加入硫酸钠不含血清的试管作为对照,将两支试管加入等量的双缩脲试剂,充分混合后于37℃环境中放置10分钟,在540nm波长进行比色,以对照管调零,读取吸光度值,由标准曲线上直接查出蛋白质含量。双缩脲法常用于0.5g/L~10g/L含量的蛋白质溶液测定。
3.酚试剂法
取6支试管分别标号,前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液,最后一支试管加待测蛋白质溶液,不加标准蛋白溶液,每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致,将液体混合均匀,在室温下放置30分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值
4.紫外吸收法
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的吸收,这是由于蛋白质中有酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸存在,可用于测定0.1~0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。取9支试管分别标号,前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液,1号试管不加标准蛋白溶液,最后一支试管加待测蛋白质溶液,而不加标准蛋白溶液,每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致,将液体混合均匀,在280nm波长处进行比色,记录吸光度值。
5.其他
除了以上介绍的方法之外,考马斯亮蓝法、二喹啉甲酸法等均可用于蛋白质测定。